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我国首例非洲猪瘟的确诊
      
原发表日期: 2018-12-10  文章来源: 新浪  
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我国首例非洲猪瘟的确诊

王清华 1,任炜杰 1,包静月 1,戈胜强 1,李金明 1,李 林 1,樊晓旭 1,刘春菊 1,王 华 1,永强 1,徐天刚 1,吴晓东 1,段亚良 2,顾贵波 2,周晨阳 2

(1. 中国动物卫生与流行病学中心,国家外来动物疫病研究中心,山东青岛 266032;2. 辽宁省动物疫病预防控制中心,辽宁沈阳 110164)

摘 要 :近日,辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡,病死猪剖检发现脾脏异常肿大,疑似非洲猪瘟病毒感染。经国家外来动物疫病研究中心检测,确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性,B646L/p72 基因序列417 个碱基与俄罗斯毒株 100% 匹配,与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒株(Georgia 2007)属于同一进化分支。这是我国发现的首例非洲猪瘟,疫情来源有待进一步调查。关键词 :非洲猪瘟 ;非洲猪瘟病毒 ;荧光定量 PCR ;普通 PCR ;ASFV 特异性抗体中图分类号 :S852.65 文献标识码 :A

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病, 临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群的病死率高达 100%。鉴于该病的严重危害性,世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。ASFV 不感染人,对人的健康不构成威胁。目前, 针对 ASF 防控,尚无有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日,国家外来动物疫病研究中心接到辽宁省沈阳市沈北区发现 ASF 临床可疑病例的报告(图 1)。截至 8 月 1 日,发病猪场累计死亡 47 头,对刚病死的 2 头猪剖检发现:脾脏极度肿大,严重梗死,质脆易碎,其中一头猪脾肿大至少 10 倍,一头猪脾肿大 5~7 倍;肺出血、质硬,有间质性肺炎变化;下颌淋巴结、肠系膜淋巴结出血,切面呈大理石样变;胃浆膜面弥漫性出血;肾肿胀明显、色淡,未见出血点;扁桃体见陈旧性出血,符合 ASF 症状。国家外来动物疫病研究中心立即开展病原学检测,证实本次疫情由ASFV 引起。这是我国历史上的首次 ASF 发病记录。

图 1 发病场地理位置

1 材料与方法

1.1 病料

病原学样品:分别来源于 2 头病死猪的剖检病料,包括全血、脾脏、淋巴结、扁桃体;30 头临床健康猪的全血。

血清样品:2 头病死猪及同群 30 头临床健康猪血清。

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的组织匀浆管(Roche)中,加入600 µL PBS 缓冲液,再加入剪碎的组织样品约 30mg,使用 HyBaid RiboLyser 组织匀浆机进行匀浆处理。取 200 µL 组织匀浆液和全血,分别使用病毒 DNA 提取试剂盒提取 DNA。最后将提取的核酸于 −80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 荧光定量 PCR

依据文献报道 [1],用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的荧光定量 PCR 方法进行 ASFVp72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为 king-s/ king-a,TaqMan 探针为 ASFVP,同时以本试验室合成的质粒 DNA 标准品为阳性对照。

1.4 普通 PCR

依据文献报道 [2],用本实验室建立的 OIE 推荐的 ASFV 特异的 PCR 方法进行 ASFV p72 基因片段的扩增。ASFV 特异性引物为 PPA1/PPA2,产物长度为 257 bp,同时以本试验室合成的质粒DNA 标准品为阳性对照。

1.5 测序片段 PCR 扩增

依据文献报道 [3-4],合成扩增 p72 基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。采用高保真的Phusion High- Fidelity PCR Master Mix 扩增B646L/p72 基因片段, 预期扩增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反应体系 为 :2X Phusion Master Mix 25 µL,p72-D(10μmol/L) 和 p72-U(10 μmol/L) 各 2 µL, 模 板DNA 2 μL,用灭菌水补齐体积至 50 μL。PCR 反应程序为:98 ℃预变性 30 s;然后进行 35 个 PCR 循环(98 ℃ 10 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s);最后 72℃ 10 min。

1.6 PCR 产物测定

扩增产物使用 1% 的琼脂糖凝胶电泳,然后切胶回收, 对回收的 DNA 直接用于测序。序列 拼 接 采 用 Lasergene 7.1 软 件(DNASTAR Inc.Madison,WI,USA) 中 的 EditSeq 与 MegAlign 模块。多序列的比对和遗传进化树的绘制,应用MEGA 5.0 软件进行。其他国家的参考毒株序列从GenBank 中获得。

1.7 抗体检测

西班牙 INGENASA 公司生产的非洲猪瘟阻断 ELISA 抗体检测试剂盒,批号为 050218。法国ID-vet 公司生产的非洲猪瘟间接 ELISA 抗体检测试剂盒,批号为 B71。国家外来动物疫病研究中心自主研发的非洲猪瘟间接 ELISA 试剂盒,批号为 201801。INGENASA 公司生产的非洲猪瘟阻断ELISA 试剂盒包被抗原为 p72 蛋白,IDvet 公司生产的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒包被抗原为p30、p62、p72 重组蛋白, 自主研发的非洲猪瘟间接ELISA 试剂盒包被抗原为 p30 蛋白。

2 结果

2.1 荧光定量 PCR

荧光定量 PCR 检测结果显示,采自 2 只病死猪的 8 份组织样品和全血中都能检测到ASFV 特异性扩增曲线,Ct 值为 19.14~26.5(图 2)。

图 2 实时定量 PCR 扩增结果

扩增曲线的横坐标为扩增循环数,纵坐标为荧光强度;绿色横线位置为荧光强度的阈值,对应的循环数为临界循环数(CT);CT 值低于 40 判定为阳性;图中扩增曲线从左至右依次为P、全血 1、脾 1、全血 2、淋巴结 2、肾 2、淋巴结 1、肾 1、脾 2

2.2普通 PCR

ASFV 普通PCR 扩增结果显示,7 个样本(分别为全血 1、淋巴结 1、肾 1、脾 1、全血 2、淋巴结 2、肾 2)在 257 bp 左右有特异性扩增条带,与阳性对照一致(图 3)。样本脾 2 特异性扩增条带较弱。

图 3 普通 PCR 检测结果

1~8. 全血 1、淋巴结 1、肾 1、脾 1、全血 2、淋巴结 2、肾 2、脾2;P. 阳性对照;N. 阴性对照;M. 分子量标记(由上至下分别为2000、1000、750、500、250、100 bp

2.3 p72 基因片段序列遗传进化分析

对样本 B646L/p72 基因片段普通 PCR 产物进行正反向测序,对得到的序列进行拼接后获得 p72基因片断序列,长度为 417 bp(图 4)。对扩增的P72 基因序列,应用邻接法(Neighbor-joining)绘制了遗传发生树(图 5)。结果显示,该样本病毒属于基因 II 型,与目前在俄罗斯和东欧流行的格鲁吉亚毒株(Georgia 2007)同属于一个进化分支。

2.4 抗体检测

对 32 份血清样品的 ASFV 特异性抗体检测结果均为阴性。

图 4 样本 p72 基因片段测序结果

图 5 P72 基因遗传进化分析

3 讨论

ASFV 是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae) 非洲猪瘟病毒属的唯一成员, 基因组为双股线状DNA,大小为 170~190 kb。根据病毒编码主要衣壳蛋白 p72 的 B646L 基因,可将该病分为 24 个与地域性相关的基因型 [5-6]。基因 II 型流行于非洲东南部,2007 年传至格鲁吉亚,并扩散到俄罗斯联邦和东欧地区 [7],已在高加索地区定殖;2017 年,该基因型病毒向东长距离跨越式传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克 [9],导致传入我国的风险空前升高。目前,ASF 已经成为困扰欧洲养猪业的一个重要问题 [8]。该病跨国界传播能力和危害性使其成为全球性的问题。

本次疫情是我国确诊的首例非洲猪瘟。该猪场生物安全条件较差,紧临车辆繁忙的乡间公路, 场区出入口无消毒池。病死猪在当地兽医部门监督下就近掩埋处理,有相应的生猪保险理赔记录。剩余存栏生猪 336 头,临床未见异常。据了解,死亡猪多为 100 kg 的大猪。p72 基因片段遗传进化分析显示,本次暴发流行的毒株为基因 II 型,与俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支,提示疫情可能来自俄罗斯和东欧疫情国家。为进一步确定病毒与俄罗斯和东欧流行株的差异,正在对全基因组序列进行分析。值得注意的是,该起疫情的病死率虽然很高(100%),但发病率和死亡率较低,发病高峰期 10 头左右,平常日均死亡 3 头左右。此外,同群猪临床健康,随机采集 30 头猪的抗凝血、血清样品的病原学检测结果和血清学检测结果均为阴性,提示该起疫情毒株的群内传播能力或有一定局限性。

感染生猪及其产品的移动是导致疫情快速远距离传播的主要途径。尤其值得注意的是,ASFV 在未经高温处理的肉品中存活能力很强,未经高温处理的泔水、烟熏肉、风干肉、腌肉、火腿等也是造成病毒跨区域传播的重要因素。历史上,多起跨境传播的 ASF 疫情与航空器、列车运载上述猪肉制品的处理不当、感染ASF 野猪移动有关[10]。目前, 应加强流行病学调查和主动监测排查工作,特别对病死猪的检测,应重点关注屠宰场、病死生猪无害化处理场等高风险场点,对已发现的确诊病例要做进一步追溯排查;加大科普宣传,发动养猪户、诊疗人员和相关从业人员主动上报可疑情况。若发生疫情,应严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》和《非洲猪瘟防治技术规范》进行处置。

致谢:

中国动物卫生与流行病学中心王志亮总兽医师在疫情调查和检测分析过程中给予悉心指导,辽宁省动物疫病预防控制中心积极协助调查并提供样品。

参考文献:

[1] KING D P,REID S M,HUTCHINGS G H, et al. Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus[J]. Journal of virology methods,2003,107(1):53-61.

[2] AGUERO M,FERNANDEZ J,ROMEROL,et al. Highly sensitive PCR assay for routine diagnosis of African swine fever virus in clinical samples[J]. Journal of clinical microbiology, 2003,41(9):4431-4434.

[3] BASTOS A D,PENRITH M L,CRUCIERE C,et al. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation[J]. Archives of virology,2003,148(4):693- 706.

[4] LUBISI B A,BASTOS A D,DWARKA R M, et al. Molecular epidemiology of African swine fever in East Africa[J]. Archives of virology, 2005,150(12):2439-2452.

[5] ACHENBACH J E,GALLARDO C,NIETO-PELEGRIN E,et al. Identification of a new genotype of African swine fever virus in domestic pigs from Ethiopia[J]. Transboundary emerging disease,2017,64(5):1393-1404.

[6] QUEMBO C J, JORI F, VOSLOO W,et al. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype[J]. Transboundary emerging disease,2018,65(2): 420-431.

[7] GALINDO I,ALONSO C. African swine fevervirus: a review[J]. Viruses,2017,9(5).

[8] SANCHEZ-CORDON P J,MONTOYA M, REIS A L,et al. African swine fever: A re- emerging viral disease threatening the global pig industry[J]. Journal of veterinary medical science,2018,233:41-48.

[9] KOLBASOV D,TITOV I,TSYBANOV S,et al. African swine fever virus,Siberia,Russia, 2017[J]. Emerging infectious disease,2018,24(4):796-798.

[10] BROWN V R,BEVINS S N. A review of African swine fever and the potential for introduction into the United States and the possibility of subsequent establishment in feral swine and native ticks[J]. Frontiers in veterinary science,2018,5:11.

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