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蛇床子素体外抗鸽毛滴虫的效果及形态学观察
      
原发表日期: 2017-12-13  原作者: 陈海华 薛勇 陈俊红 金李萍 沙奕羽 戴鼎震  
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摘要:为了观察蛇床子素对体外培养抑制鸽毛滴虫的效果及其对形态学的影响,试验分为4组,蛇床子素浓度分别为0(空白)、1、3、5 mg/mL,分别在培养2、4、6、8、12、24 h从各组取样,于光学及电子显微镜下观察鸽毛滴虫的形态学变化,记录死亡情况。结果显示:随着蛇床子素浓度的增加,鸽毛滴虫的死亡率随之升高,死亡时间随之缩短,5 mg/mL组的效果最佳,用药12 h即可杀灭全部的毛滴虫,浓度为1mg/mL的药物组至24 h仍未全部死亡,浓度为3 mg/mL的药物组至24 h全部死亡。扫描电镜观察显示,药物作用初始阶段鸽毛滴虫由梨形逐步变圆,形态完整;不久虫体边缘模糊,表面出现皱褶,局部有凹陷;接着凹陷面积扩大,内部出现空洞,虫体形状变得不规则,最后虫体崩解成碎片。结果表明蛇床子素具有明显的抗鸽毛滴虫的效果,值得进一步研究。
关键词:蛇床子素;鸽毛滴虫;体外培养;形态学

Observation on trichomonacidal effect and morphological
changes by Osthole against trichomonas gallinae  in vitro

Abstract:Observed the pigeons trichomonas morphology that effected by Osthole in vitro. Test is divided into blank group and medicine group which include Osthole concentration respectively 1,3,5mg/ml.Adding trichomonas gallinae to blank group and medicine group ,sampling in microscope to observe its morphological changes and record its mortality until cultivating2, 4, 6, 8, 12, 24h.Results Display that with the increase of Osthole concentration, mortality  will increase, the time of death will shorten.Medicine group 5 mg/ml  shows the best results, after 12 h all trichomonas were kill by Osthole, while group 1 mg/ml’s trichomonas  are not all death until 24h, Osthole 3 mg/ml killed all the trichomonas until 24 h .Scanning electron microscopy (sem) shows that change its pear-shaped to gradually in initial stage,Not long after we can see trichomonas body blurry edges,surface wrinkles,Local depressions.Then Sag area increased,internal pores shaped,the body shap become irregularly and collapse into pieces.Results show that the Osthole has obvious effect in trichomonias gallinae , deserves further research.
Key words: Osthole; trichomonas gallinae ; in vitro; morphology

鸽毛滴虫属鞭毛亚门、动鞭亚纲、多鞭毛目、毛滴虫科、毛滴虫属,是肉鸽养殖业最常见的一种原虫性疫病,由于父母鸽与幼乳鸽之间口对口的喂养方式,使得个群个体之间的感染率高达95%以上。鸽毛滴虫主要侵害宿主的上消化道,导致溃疡,然后由溃疡处进入体内循环系统,到达肝脏并分泌半胱氨酸蛋白酶引起肝细胞的致细胞病变效应,引发干酪样损伤,因此致病性强的鸽毛滴虫不仅能感染宿主消化道,严重时甚至还可以扩散到宿主肝脏、心脏等内脏器官,如果不及时治疗,幼鸽往往会因机能衰竭而死亡,种鸽则继续保持带菌状态,成为传染原[1-3]。防治鸽毛滴虫病,以前多使用甲硝唑和替硝唑等药物,效果很好,但长期使用存在较大毒副作用,现已列入食品动物禁用的兽药目录中。因此,研究安全、高效、毒副作用少的抗鸽毛滴虫药物具有十分重要的意义。我国传统医药中有部分中草药具有明显的体外抗鸽毛滴虫作用,如蛇床子、白头翁、金莲花、苦参、花椒、常山、青蒿等[4-6]。石达友等[7]通过试验证明蛇床子提取物具有抗鸽毛滴虫的作用,虽然蛇床子提取物具有较好的抗毛滴虫作用,且常用于治疗阴道毛滴虫疾病,但目前未见关于蛇床子单一有效成分作用于鸽毛滴虫的效果观察及形态学观察。本研究选用蛇床子单一成分蛇床子素,通过体外培养观察不同药物作用时间下鸽毛滴虫的死亡率及其在光学显微镜和扫描电镜下的形态学变化,为寻找抗鸽毛滴虫的替代品提供研究基础。
1材料与方法
1.1鸽毛滴虫
分离自1~2月龄患病幼鸽(300±50)g口腔及鼻窦,由金陵科技学院兽医寄生虫实验室提供。
1.2 药品和试剂
蛇床子素(纯度98%,西安圣青生物科技有限公司)蛋白胨(生化试剂,西陇化工股份有限公司)麦芽糖(食品级,纯度>98%,西陇化工股份有限公司),氯化钠(分析纯,西陇化工股份有限公司),L-半胱氨酸盐酸盐(食品级,纯度>98%,西陇化工股份有限公司),两性霉素B、青霉素、链霉素(生化试剂,北京莱耀生物科技有限公司)。
1.3 鸽毛滴虫的体外液体培养
1.3.1肝浸汤培养基的制备
取15g新鲜猪肝,剪成米粒大小,加入适量纯水后放入4℃冰箱过夜。次日,将猪肝熬成肝浸汤,双层纱布过滤,取上清液。于上清液中加入适量的L-半胱氨酸、蛋白胨、氯化钠,纯水定容至100 mL,调pH至5~6,8磅20 min高温高压灭菌后于4℃冰箱保存备用。使用前加入20%灭菌小牛血清,10 μg/mL两性霉素B及青霉素、链霉素各100 U/mL。
1.3.2取样并接种
将医用消毒棉签用生理盐水润湿后经紫外消毒半小时后,于病鸽口腔中采集其口腔黏液及鼻窦黄白色分泌物。将采集到的病料接种于5 mL肝浸汤培养基中,置于37℃恒温培养箱中培养。
1.4蛇床子素体外抗鸽毛滴虫样品制备
取体外稳定培养3代的鸽毛滴虫进行分步离心筛除死亡及活力不强的虫体[8],并用肝浸汤配制成一定浓度备用。将蛇床子素用含有体积分数为0.2%吐温-80的肝浸汤培养基配置成一定浓度备用。试验分为药物组和空白组,其中药物组的蛇床子素浓度分别为1、3和5 mg/mL;空白组不加药,其余因素同于药物组。每个试验组设三个平行对照,且鸽毛滴虫的终浓度为2×105个/mL。将药物组和空白组置于37℃恒温培养箱中培养。分别于恒温培养2、4、6、8、12、24 h取样用血球计数板计数并计算鸽毛滴虫的死亡率。光学显微镜下可明显看到毛滴虫在血球计数板上的活力状况,用药后若镜检发现虫体在血球计数板上不动则视为虫体死亡。取上述不同时间段的虫液于光学显微镜(×1000)倍镜下观察虫体的活力及形态学变化情况。
1.5 蛇床子素体外抗鸽毛滴虫扫描电镜样品制备
药物组和空白组的制备同于光学显微镜的样品制备。分别在0.5、2、4h进行虫体收集,离心,去上清,然后用pH=7.4的PBS液在1 500 r/min条件下离心10 min,连续2次。去上清,将2.5%戊二醛加入沉淀中加以固定,固定时间为2h。蔗糖PBS缓冲液冲洗完后用锇酸固定1 h,用不同浓度酒精逐级脱水,酒精浓度分别为30%、50%、70%、90%等,最后干燥喷金,扫描电镜观察。

2 结果与分析
2.1 蛇床子素体外对鸽毛滴虫的杀伤作用
表1数据显示,同一药物作用时间,鸽毛滴虫的死亡率随着蛇床子素浓度的增加而升高,且死亡率均明显高于空白组,在药物作用12 h后,5 mg/mL组鸽毛滴虫的死亡率达到100%,3mg/mL组鸽毛滴虫的死亡率为87.54%,1mg/mL组的死亡率为56.93%,空白组的死亡率仅为10.62%;同一蛇床子素浓度,鸽毛滴虫的死亡率随时间的延长而增加,在药物作用2~12 h,5mg/mL组鸽毛滴虫的死亡率从32.23上升到100%,3mg/mL组鸽毛滴虫的死亡率从19.78%上升到87.54%,1mg/mL组鸽毛滴虫的死亡率从11.15%上升到56.93%,而空白组鸽毛滴虫的死亡率保持在一个低水平,且上升幅度较小,从0.89%上升到15.21%。我们可以明显地看到,蛇床子素高浓度组5mg/mL体外作用于鸽毛滴虫的效果最好,在作用12h即可全部杀死鸽毛滴虫。

表 1  蛇床子素体外抗鸽毛滴虫的死亡率计算结果 
用药时间/h 死亡率(%)
5 mg/mL组 3 mg/mL组 1 mg/mL组 空白组
2 32.23±0.59* 19.78±2.30* 11.15±1.89* 0.89±0.78
4 50.28±0.92* 38.01±0.65* 15.67±1.65* 1.67±0.95
6 83.12±0.99* 65.13±2.73* 29.26±0.76* 2.93±1.46
8 92.88±0.65* 79.02±1.98* 35.66±1.42* 3.08±1.77
12 100.00±0.00* 87.54±1.78* 56.93±2.56* 10.62±2.65
24 100.00±0.00* 100.00±0.00* 88.35±2.31* 15.21±2.14
注:同一时间内,各药物组与空白组比较,*P<0.01,差异极显著。

2.2 蛇床子素体外对鸽毛滴虫的形态学影响
2.2.1 光镜观察
1000倍光镜下,正常鸽毛滴虫大多数为梨形或者椭圆形,4根鞭毛清晰可见,波动膜摆动极为明显,虫体十分活跃,大多数做螺旋运动,少部分作突进式运动(见图1-A)。在蛇床子素的作用下,虫体的活力和形态学受其作用时间和浓度的影响。当蛇床子素作用的时间越长,毛滴虫的活力逐渐减弱,形态学破坏程度也随之加深。起始阶段,虫体边缘清晰,形态完整,出现少量空泡,波动膜和鞭毛仍有明显的摆动,但其摆动频率低于正常的鸽毛滴虫(图1-B);紧接着虫体边缘模糊,虫体变圆变大,并出现数量不一及大小不等的空泡,波动膜波动不明显,此时期的毛滴虫基本无活力,只有极少数在原地做螺旋运动(图1-C);最后,虫体的波动膜及鞭毛脱落,胞内颗粒样物质增多,空泡变大变多,虫体边缘出现缺口,内容物大量外泄,虫体裂解死亡(图1-D)。当蛇床子素浓度升高,鸽毛滴虫的死亡时间随之缩短。蛇床子素5mg/mL组的死亡时间最短,在其作用12h,所有鸽毛滴虫皆死亡,镜检可见大量大小不一的颗粒样物质及少数膨胀变大无活力的毛滴虫;3mg/mL组的鸽毛滴虫全部裂解死亡的时间为24h;而1mg/mL组的效果相对较不明显,蛇床子素作用24h只能杀死88%以上的毛滴虫,镜检可见大量膨胀变大未裂解的鸽毛滴虫,部分颗粒样物质及少量活力较好的鸽毛滴虫。


图1 蛇床子素体外作用于鸽毛滴虫的光镜观察


2.2.2 扫描电镜观察
对照组鸽毛滴虫虫体表面光滑,多数呈梨形或者椭圆形轮廓,虫体特征清晰可见。4根在初始段相互靠近的鞭毛长度大体相等,另有一根后鞭毛贴近波动膜边缘向后延伸,形状似波浪形(图2-A)。当蛇床子素作用0.5h时,虫体表面开始皱缩,变得不光滑,有的开始出现小空洞(图2-B)。2h以后,虫体表面空洞数量增多,凹陷增大,表面粗糙不平,边缘变得不规则(图2-C)。药物作用4h时,虫体边缘变得极不规则,表面凹陷进一步加深,形似“菜花样”,虫体严重变形,胞内颗粒样物质外泄(图2-D)。

A :对照组鸽毛滴虫,虫体表面光滑,多数呈梨形或者椭圆形轮廓,虫体特征清晰可见;B:药物作用0.5h,虫体表面皱缩,变得不光滑 ;C:药物作用2h,虫体表面空洞增多,表面粗糙不平,凹陷增大,鞭毛依旧存在存在;D:药物作用4h,虫体严重粗糙不平,凹陷进一步扩大 ,胞内内容物外泄。
图 2 蛇床子素体外作用于鸽毛滴虫的扫描电镜观察
3 讨论
中药成分抗鸽毛滴虫的研究报道较少,而中草药成分抗人的阴道毛滴虫的报道则较多,常用的抗阴道毛滴虫中草药有白头翁、蛇床子、苦参、花椒、金莲花等。夏敏玲[9]等研究了蛇床子素体外杀灭阴道毛滴虫的效果,得出蛇床子素具有良好的抗阴道毛滴虫的作用,且其最低有效浓度为1.12 mg/mL的结论;闫艳[9]等考察了白头翁体外抗阴道毛滴虫的效果及形态学变化,发现白头翁水提物的作用时间越长且浓度越高,阴道毛滴虫的死亡率也随之升高。鉴于鸽毛滴虫和阴道毛滴虫同为毛滴虫科, 推断抗阴道毛滴虫的中草药也能作用于鸽毛滴虫,因而有的学者尝试使用中草药来抗鸽毛滴虫。
本试验将蛇床子素应用于体外抗鸽毛滴虫的效果及形态学观察,并得到了与预期设想相符的结论。试验中选用蛇床子素,用肝浸汤将其制备成一定浓度后体外作用于鸽毛滴虫,计算其死亡率,并置于光镜下和扫描电镜下观察其形态学变化。结果显示,蛇床子素具有较好的抗鸽毛滴虫作用,且蛇床子素浓度越高,鸽毛滴虫的死亡率越高,死亡时间也随之缩短,其中5 mg/mL的效果最明显,12h之内就能全部杀死鸽毛滴虫。这与夏敏玲[9]等人所研究的蛇床子素体外抗阴道毛滴虫的药效结果相近。由此可见,将具有抗阴道毛滴虫效果的中草药及其提取物应用于抗鸽毛滴虫的研究中的设想切实可行。
通过扫描电子显微镜观察发现,尽管蛇床子素浓度有高低,随着蛇床子素作用时间的推移,每个试验组鸽毛滴虫均经历了虫体表面出现皱纹、肿胀、逐步出现凹陷、并进而形成空洞、最后虫体崩解死亡这样一个过程,蛇床子素浓度越高,鸽毛滴虫经过上述这个过程形态学变化的时间越短。在光镜下,可以观察到鸽毛滴虫的形态学受蛇床子素浓度及其作用时间的影响,作用时间越长,鸽毛滴虫的形态变化越严重,从形态完整到膨胀变大、有颗粒物出现再到内容物外泄,最后到裂解死亡。这种结果类似于孙静静等人在400倍光学显微镜下观察了金莲花等复方提取物对鸽毛滴虫的形态学变化,结果发现随着药物作用时间的延长,毛滴虫活力减弱,虫体膨胀变大,结构变圆,出现空泡,内容物外泄[10]。空白组的鸽毛滴虫形态学变化基本上与杨秀环等人报道的相似[11],通过光学显微镜观察可见正常鸽毛滴虫的形态为梨形或椭圆形,含四根游离鞭毛,一根轴次,波动膜始于虫体前短止于虫体后端靠前段,通常做螺旋运动或者布朗运动。虽然空白组在24h内也有鸽毛滴虫死亡,但数量比用药组显著减少。
以上试验研究证实,一定浓度的蛇床子素能够有效地抑制鸽毛滴虫的生长繁殖,并导致其发生产生皱纹、肿胀、出现空洞并最终完全崩解死亡,因此值得进一步扩大试验,观察体内抑杀鸽毛滴虫的效果。   

参考文献:
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[11]杨秀环, 白如念, 李志衍,等. 鸽毛滴虫形态学观察研究[J]. 当代畜牧, 2012(2): 30-31.

 

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